1937年，卢沟桥事变后，上官云珠随家人离乡出走，辗转避难到上海，找到法租界的大姐韦均伟、三哥韦宇平处暂住 。1938年5月，进入何氏照相馆任职 。1940年4月，经何佐民介绍，考入了华光戏剧专科学校学习话剧 。不久，华光戏剧学校停办，上官云珠转入新华影业公司演员训练班 ；同年，参演个人首部电影《王老虎抢亲》 。
1941年，在话剧《雷雨》中饰演丫鬟四凤；同年，与李丽华、张翠英联合参演剧情电影《玫瑰飘零》 ；接着，与黄河共同主演爱情电影《国色天香》，饰演明光大戏院的歌女赛珍 ；此外，还与张翠英合作主演了悬疑电影《黑衣盗》。
1948年，与蓝马、吴茵联合主演剧情电影《万家灯火》，在片中饰演思想传统的贤淑主妇又兰。1949年，与蓝马共同主演剧情电影《希望在人间》，在片中饰演坚定沉着的教授夫人、妇科医生陶静寰 ；同年，与赵丹、吴茵联袂主演剧情电影《乌鸦与麻雀》，在片中饰演忍辱负重的华太太 ，她凭借该片获得中国文化部优秀影片个人一等奖。
1954年，担任上海电影制片厂的演员 ；同年，为剧情电影《曙光照耀着我们》配音；此外，还配音了剧情电影《玛丽娜的命运》。1955年，与孙道临共同主演剧情电影《南岛风云》，在片中饰演英姿飒爽、老练果敢的革命英雄符若华 ；同年，为剧情电影《世界的心》配音。
1956年，由其参演的剧情电影《小白旗的风波》上映 ；同年，为剧情电影《牛虻》配音。1959年，在喜剧电影《今天我休息》中饰演儿科大夫 。1961年，与尤嘉合作主演剧情电影《枯木逢春》 。1962年，上官云珠被中国文化部评为中国电影二十二大影星 。
1968年9月，由江青直接操纵的“上官云珠专案组”和林彪秘密成立的“上官云珠特别专案组”，相继逼迫上官云珠写出与毛主席以及其它首长在一起的交待材料 ；11月22日，上官云珠又被专案组提审 ；11月23日凌晨，上官云珠跳楼自杀，享年48年 。
1978年，中共上海电影局委员会对上官云珠恢复名誉 。1994年，上官云珠获得宝钢高雅艺术奖。1995年，上官云珠获得中国电影世纪奖最佳女演员奖。2005年，上官云珠获得中国电影百位优秀演员奖 。
作为女性演员，上官云珠敏锐的政治感觉和精明世故的为人都为她的演艺道路增添了政治的意味和时代的特色。上官云珠与作为消费文化对象的女性呈现不同，在电影中的身体呈现是经历了从交际花角色到平民女性角色的转变，这一转变是自主自觉的，而非被动的 （《河北大学学报》评）。
上官云珠艳丽的外貌和气质，非常适合扮演中产阶段少妇，在电影《太太万岁》和《一江春水向东流》里，塑造了20世纪40年代上海典型的艳妇形象。上官云珠也能娴熟地饰演社会地位完全不同的女性。作为一个演员的表演技巧，得到了清晰的展现，她在银幕上塑造的女性形象人物身份跨度之大，性格特点之鲜明，是非常突出的 （《电影新作》评）。
2007年11月9日，上官云珠纪念馆在江阴市长泾镇正式开馆 。上海电影家协会向纪念馆捐赠了一批上官云珠的照片、文章、光盘等资料，刘子枫将其书法作品“长泾出上官，影坛留云珠”捐赠给纪念馆，上官云珠的小儿子韦然将母亲获得的中国电影百年百位优秀演员奖杯捐赠给纪念馆。
