吴彦祖出生于加利福尼亚州伯克利，并在奥林达长大 。6岁时，吴彦祖在看完功夫电影《少林寺》后，对武术产生了兴趣 。11岁时，吴彦祖便拜一名北京艺人为师开始习武，教他的师父是吴彦祖的母亲找的，而此前，他的母亲还担心他学会了功夫跟人打架，但最后还是拗不过他对习武的热情 。高中时，吴彦祖也曾叛逆过，经常在街上玩滑板，听的是朋克、重金属、饶舌等地下音乐，喜欢打架更甚于学习。这一切直至他的母亲因心脏病住院才有了彻底的改变。在母亲生病期间，吴彦祖白天在学校认真读书，下课后就到医院陪母亲。为此他甚至去学习了简单的气功疗法，用来辅助母亲的治疗 。
1993年，吴彦祖在美国俄勒冈大学攻读建筑系，并获得建筑副修奖学金。1994年，吴彦祖赢得CaliforniaMartialArtCompetitions的亚军，并在美国西岸排名第二位。同时，吴彦祖还成立了俄勒冈大学中国武术学会，并成为第一任教练，收了二十几个徒弟，一共教了五年。1995年，吴彦祖随师父到北京什刹海武校参加集训，并获得了北京国际武术比赛长拳组第五名，太极拳组第六名 。
1997年，毕业后的吴彦祖前往香港旅行，后在姐姐的建议下开始当模特。四个月后，导演杨凡在看到吴彦祖拍摄的服装广告后，与他接洽成为他下一部电影的演员，而吴彦祖表示自己没有表演经验而拒绝了。后来杨凡天天给吴彦祖打电话并说服了他。
1999年2月13日，吴彦祖与成龙、舒淇合作主演的爱情喜剧片《玻璃樽》上映；6月13日，主演的动作片《特警新人类》上映；同年，主演动作片《紫雨风暴》，饰演一名叫多特的恐怖分子到失忆变成警方卧底的周世杰 。
2001年，首次与古天乐合作，并出演了动作片《野兽之瞳》，片中饰演个性内向的贺冲 ；10月25日，由张婉婷执导的青春爱情片《北京乐与路》上映，吴彦祖则在片中饰演热爱音乐的Michael 。
2002年，吴彦祖与杨千嬅首次合作，并出演了爱情喜剧片《新扎师妹》；同年，在由张艾嘉执导的科幻爱情片《想飞》中饰演自信固执的创作总监卓克 ；6月14日，主演的惊悚动作片《变脸迷情》上映；11月15日，其搭档李美琪主演的动作片《赤裸特工》上映，并在片中饰演专案小组指挥员杰克 。1998年《美少年之恋》惊鸿一瞥
2003年3月，再次与杨千嬅合作出演了喜剧片《新扎师妹2》 ；8月21日，由吴彦祖首次担任监制并主演的惊悚片《妖夜回廊》上映，他在片中挑战一人分饰两角，饰演了一对反差复杂、背景凄惨的孪生兄弟袁森和阿洪，他还凭借该片中的表现入围了第40届台湾电影金马奖最佳男主角 ；11月，主演古装喜剧片《花魁杜十娘》。
2005年，吴彦祖与梁家辉、郑秀文合作，主演了根据同名小说改编的爱情片《长恨歌》，并在片中饰演温文尔雅但懦弱无助的康明逊 ；同年，首次与内地导演合作，出演由冯小刚执导的古装剧情片《夜宴》，吴彦祖在片中饰演了太子无鸾一角，而这也是他首次尝试古装造型 。
2007年2月13日，吴彦祖与尔冬升导演合作的犯罪剧情片《门徒》上映，他在片中饰演亦正亦邪的警方卧底李志力 ；8月16日，由吴宇森担任监制的动作片《天堂口》上映，吴彦祖在片中饰演从穷小子变成为上流社会人士的阿峰 。2008年，吴彦祖联同林建岳成立了星革盟有限公司（RevolutionTalentManagementLtd）经纪公司 。
2010年2月11日，吴彦祖与徐若瑄等众多艺人联合主演的爱情片《全城热恋》上映，片中饰演一名寿司司傅 ；3月，担任第34届香港国际电影节国际短片竞赛单元评审 ；4月30日，吴彦祖搭档袁泉主演的爱情片《如梦》上映，他在片中饰演患有自闭症的软件工程师麦克，并凭借该角色提名第46届台湾电影金马奖最佳男主角 ；7月2日，与古天乐、李冰冰合作主演的动作片《枪王之王》上映，吴彦祖在片中饰演了心思缜密的警官庄子维 。
2012年5月4日，由伍仕贤执导的剧情片《形影不离》上映，吴彦祖在片中饰演患有心理疾病的工程师李越 ；9月27日，吴彦祖担任监制并出演的武侠动作片《太极2：英雄崛起》上映，他在片中挑战出演造型邋遢、身披袈裟的世外高僧疯和尚 ；11月29日，与刘烨、张震合作主演的古装历史片《王的盛宴》上映，吴彦祖则在片中饰演了西楚霸王项羽一角 。
2013年11月22日，吴彦祖担任监制并主演的犯罪动作片《控制》上映，他在片中饰演具有双重人格的保险业务员马克 ；同年，搭档沙尔托·科普雷主演了科幻惊悚片《木卫二报告》，吴彦祖在片中饰演太空宇航员威廉姆·徐 。
2015年8月13日，搭档白百何主演的励志喜剧片《滚蛋吧！肿瘤君》上映，该片根据同名漫画改编，吴彦祖在片中出演医术卓绝的梁医生，该片上映后取得5.1亿元的票房成绩[47-48] ；11月15日，吴彦祖担任制作人并主演的功夫美剧《荒原第一季》在美国AMC电视台首播，他在剧中饰演了武艺精湛的杀手Sunny 。
2017年3月19日，吴彦祖主演的功夫美剧《荒原第二季》在美国AMC电视台首播，该剧平均收视率达3.6M，在美国有线平台排名第4 ；10月13日，其首次参加的户外建筑真人秀节目《漂亮的房子》在浙江卫视播出 ；10月20日，与杰拉德·巴特勒、吉姆·斯特吉斯合作主演的科幻灾难片《全球风暴》在美国上映，吴彦祖在片中饰演的郑龙是一名数据分析师，该片于10月27日在中国内地上映 。
2018年3月16日，搭档艾丽西亚·维坎德主演的动作奇幻片《古墓丽影：源起之战》在美国和中国内地同步上映，吴彦祖在片中饰演特立独行、经验丰富的船长陆仁 ；4月22日，与艾米丽·比查姆、阿拉米斯·奈特合作主演的美剧《荒原第三季》在美国AMC电视台首播 。
2019年5月16日，吴彦祖受邀出席第72届戛纳国际电影节红毯 。2020年11月20日，吴彦祖领衔主演的动作警匪片《除暴》上映 ，他在片中饰演自负狂妄、罪行累累的“老鹰”张隼 。
2021年8月20日，与休·杰克曼、丽贝卡·弗格森合作主演的科幻动作片《追忆迷局》定档于北美上映 。
家庭
吴彦祖的父亲是电气工程师，从事设计核电站工作；他的母亲是大学心理学教授；还有两个姐姐分别年长吴彦祖10岁、12岁 。
2014年6月18日，吴彦祖表示因母亲重病决定暂停所有工作，并与另一老板林建岳商讨后解散了经纪公司星革盟有限公司 ；8月12日，吴彦祖在其个人微博否认退出娱乐圈，表示热爱演艺工作，从没想过退出，并开始全面复工 。
婚姻
2010年4月6日，吴彦祖与相恋8年的LisaSelesner在南非举行婚礼，7月28日，两人在香港补摆喜宴 。2013年5月30日，吴彦祖的妻子产下一女，女儿取名吴斐然；6月5日，吴彦祖首度公开女儿的正面清晰照 。
2006年底，在中国香港“SuperStars”影展及摄影集慈善义卖活动上，余文乐、吴彦祖、郭富城等300多位明星为慈善活动所拍摄的裸照曝光 。
2008年6月4日，吴彦祖录制爱心视频并参与了周迅发起的“星星之火，传爱四川”行动 。
2013年11月1日，“2014爱·家庭慈善月历”在香港推出，包括吴彦祖等在内的12个明星家庭齐心推动此公益活动 。
2018年1月6日，吴彦祖参与设计的作品“木兰坊”入围了有"建筑界奥斯卡"的英国皇家建筑师学会奖。这是吴彦祖与好友冯德伦参加真人秀节目《漂亮的房子》时，其团队与建筑师张海翱合作前往中国河北木兰围场，以80万元的预算兴建了一座可居住的图书馆“木兰坊” 。
吴彦祖是个很纯静很优秀的男生，他不仅人长得帅，对人也热情有礼貌。在片场工作很认真，是个很有志向的人（导演张婉婷评） 。
吴彦祖外形帅气阳光、演技出挑，从小习武的他在很多动作片里都有过出色表现。不论是主角配角、正派反派或是亦正亦邪，吴彦祖都愿意尝试，能够胜任每个内心丰富的角色。吴彦祖不轻易被定型，不仅戏路更加宽广，也让观众对他一直保有一定的新鲜感（腾讯网、钱江晚报、光明网评） [83-85] 。
吴彦祖是一个非常安静，非常善良，非常绅士的人。而他表演时候的一举一动，我们看到他的眼神，都足以让你感受到古尔丹的力量。这是他的演技的体现（宝拉·巴顿评） 。吴彦祖工作非常认真，是一位非常杰出的演员（凯文·史派西评） 。
